原型物種
來源
模式動物品系
實驗分組
實驗周期
建模方法
應用
1. 觀察各組大鼠的活動量、毛發、食量、呼吸、體重等。每周給食前1h稱重,觀察體重的變化。
2. RT-qPCR檢測
收集大鼠PBMC和肺組織,提取RNA,利用RT-PCR檢測Foxp3、RORγT的表達。
3. Western blot檢測
收集大鼠PBMC和肺組織,提取蛋白,采用western-blot檢測TAZ水平。
4. 流式細胞檢測外周血T淋巴細胞亞群
收集各組大鼠腹主動脈血2ml左右,利用大鼠外周血淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞(PBMC)細胞懸液。
(1)檢測Th17時,細胞懸液加入佛波酯(50ng/ml)、離子霉素(1μg/ml)和莫能菌素(2μmol/L),37℃、5%CO2培養箱終培養6h后,反復洗滌3次后100μL PBS重懸,然后加入CD4單克隆抗體10μL,混勻后4℃避光孵育30min,洗滌、固定、破膜,再加入IL-17單克隆抗體10μL,4℃避光孵育20min,反復洗滌后PBS重懸為500μL/管,樣品置流式細胞儀檢測CD4+IL-17+細胞占CD4+T細胞的比例。
(2)檢測Treg細胞時,細胞懸液先加入CD4、CD25單克隆抗體各10μl,混勻后4℃避光孵育30min,洗滌、固定、破膜,再加入FoxP3單克隆抗體10μL,4℃避光孵育20min,反復洗滌后PBS重懸為500μL/管,樣品置流式細胞儀檢測CD4+CD25+FoxP3+細胞占CD4+T細胞的比例。
HE染色:右肺葉組織固定包埋切片,HE染色,觀察肺組織病理變化情況。
ELISA檢測:
檢測血清和支氣管肺泡灌洗液中的IL-17和IL-10水平。
支氣管肺泡灌洗液(BALF)抽取方法:大鼠取血后,開胸,分離縱膈,注射器抽取3ml生理鹽水從氣管插管推入肺中,每次反復灌洗3次后抽出灌洗液,肺泡灌洗液以4℃ 3000r/min離心15min,取上清。
血清提取方法:將收集于血清分離管中的全血標本在室溫放置 2 小時或 4oC 過夜,然后 1,000×g 離心 20 分鐘,取上清即可,將上清置于-20oC 或-80oC 保存,避免反復凍融。
應用SPSS軟件進行統計分析,計量資料以均數±標準差(x ±s)表示,采用t檢驗,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示有顯
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