快速衰老模型——SAMP8 Mice
一、品系名稱
品系名稱：SAMP8 Mice
別名：SAMP-8, SAM-P/8, SAM-P8
毛色：白化
編輯類型：自發突變
疾病相關：阿爾茨海默癥
遺傳背景：AKR/J，疑似雜交了未知品系
繁育方式：近交繁殖或體外受精，
二、衰老動物模型
人類衰老機制研究和抗衰老藥物篩選的重要手段是選擇合適的衰老動物模型。應用衰老動物模型對AD進行實驗研究具有一定的代表意義。在實驗研究中應用的衰老動物模型主要有自然衰老動物模型和快速老化動物模型。
自然衰老模型
自然衰老動物模型是通過對1~2月齡的大小鼠日常維持飼養到小鼠18~24月齡、大鼠24月齡基本相當于人類56 ~ 70歲來構建衰老動物模型。自然衰老動物模型建模簡單，在衰老期時出現腦內神經元變性、膽堿能功能降低、感覺、行為和記憶障礙等與臨床患者相似的各種病理特征。因此，在AD研究中自然衰老動物模型作為首選動物模型。
但自然衰老模型的缺點是建模時間較久，一般情況下要飼養15個月以上（雖可以直接購買適齡動物，但成本非常高），由于在建模過程中飼養時間過長，投入的人力和物力成本相對較大，另外，在飼養過程中感染其他疾病機率也相對較高且健康狀態較差，特別是進入老齡期后容易死亡，在后期樣本檢測中個體差異大。
快速老化模型
日本京都大學竹田俊男教授在 1968 年培育出快速老化小鼠（SAM），在此基礎上又于 1975 年培育出易快速老化系小鼠（SAMP）和抗快速老化系小鼠（SAMR）。其中 SAMP8 小鼠在學習記憶減退、神經遞質改變、APP代謝異常、Aβ沉積等方面表現出與年齡相關的AD臨床特征，一致認為是研究 AD 最好的動物模型。
SAMP8小鼠的一般生存時間為12-13個月，在6個月齡之后進入老化加速期。在月齡相同情況下，SAMR1小鼠表現出抗癡呆特征，在實驗研究中一般作為SAMP8 鼠的對照。快速老化小鼠具有飼養周期短，衰老特征明顯的優點，但快速老化小鼠相比其他模型小鼠價格較貴，且SAM 動物繁殖能力較弱，相對來源較少，具有一定的局限性。
三、起源
1968年，美國(Bar HarberME)JAX贈送給日本京都(Kyolo)大學幾對AKR/J系小鼠。在繁殖飼養過程中，Takeda等人發現有幾窩小鼠表現有程度
不同的脫毛、皮膚粗糙、白內障、行為障礙及生存期縮短等現象，且具有遺傳傾向，1975年，他們精心挑選了5窩表現明顯衰老的AKR/J小鼠作為P系祖先，表現有正常衰老過程的小鼠作為R系相先。選擇P系、R系的主要標準是以老化度評分(在8月齡時衰老程度)、生存期限及與衰老相關疾病的病理學改變為依據。根據生存曲線(Gompertzian function)及老化度評分標準得出P系小鼠的衰老特征為快速老化。因此，P系稱為快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/prone，SAMP)，R系稱為抗快速老化小鼠。
SAMP在渡過一段正常生長期(4～6月齡)后迅速出現行動反應遲緩、被毛光澤減退、脫毛、皮膚潰瘍、眼周損害、角膜潰瘍、白內障、脊柱彎曲等老化特征。SAMR表現為正常衰老，一般作為SAMP的正常對照。快速老化癡呆模型小鼠SAMP8是SAMP系中的一個亞系，主要以學習、記憶能力障礙為老化特征，是目前公認的比較理想的自然衰老癡呆模型。此后，除維持兄妹交配外，根據其衰老等級分值、壽命和病理表型進行選擇性地繁育，繁育出9個P系即P1、P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10和P11，3個R系即R1、R4和R5。各系小鼠有不同的特征性病理表現。SAMP8小鼠壽命一般為12-13個月。統稱SAMP和SAMR系為快速老化小鼠。8月齡時SAMP的老化度評分為7.97，為SAMR的2倍(3.94)。SAM屬近交系小鼠，增齡過程中出現許多與衰老相關的功能紊亂，如免疫功能紊亂，肺泡擴張，聽力損傷，退行性骨關節炎，骨質疏松，伴有或不伴有腦萎縮的學習記憶功能障礙等。迄今為止，SAM己被廣泛用于衰老相關性疾病及分子機制的研究。
四、特征/用途
1、神經病理
SAMP8在增齡過程中腦內有大量Aβ沉積，Northern雜交法檢測表明，β淀粉樣蛋白前體(APP)mRNA表達水平無明顯變化。從4到12月齡，海馬區Aβ增加，但沒有剛果紅 (Congo red)或硫磺素 (Thioflavine S)染色的類斑塊結構。海綿狀變性：腦干神經元突觸間隙中大小不同的空泡 (Yagi et al., 1989)。小膠質細胞增生 (Amano et al., 1995)。在黑質多巴胺神經元和藍斑去甲腎上腺素神經元中發生退化 (Karasawa et al., 1997)。
2、認知/行為
SAMP8在增齡過程中出現的學習記憶功能障礙與腦內相應神經遞質改變密切相關，如大腦皮層和海馬部位乙酰膽堿(Ach)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)降低及阿片肽、Y-氨基丁酸(GABA)升高，5-羥色胺(5-HT)表現為先升高后降低等。
與年齡相關的行為障礙，包括學習和記憶困難 (Miyamoto et al., 1986)，情感障礙，如減少的類焦慮行為和抑郁行為 (Miyamoto et al., 1992)，以及自發運動和飲水的晝夜節律發生改變 (Miyamoto, 1997)。
3、免疫
SAMP8在2月齡時就出現免疫功能異常，對綿羊紅細胞(SRBC)誘導的脾細胞抗體生成反應、Con A誘導的淋巴細胞增殖反應及IL-2產生能力均明顯下降。進一步研究發現，SAMP8脾臟CD+4細胞數目及功能下降，NK細胞數量正常。用免疫增強劑后，NK細胞活性明顯增強，表明NK細胞活性降低可能與IL-2水平下降有關。
用途：研究衰老與學習記憶功能及學習記憶功能障礙發生機制和評價益智藥物的良好動物模型，而且是研究神經內分泌免疫調節網絡平衡的良好模型。
SAMP8還有以下形態學特征：
1.以腦干為中心出現海綿狀變化
SAMP8在幼齡時腦組織即出現海綿狀變化，對照組R1小白鼠幾乎見不到。如2月齡后以腦干、延髓的網狀結構為中心，出現許多空泡性變化并呈海綿狀。空泡定量分析表明，空泡的大小和數目伴衰老增加，且與學習記憶缺陷的程度密切相關。用膠質細胞纖維酸性蛋白 (GFAP) 染色,早期可見伴有大量的和廣泛的星形細胞增生。空泡性變化在8個月時其峰值下落，至老齡則不明顯。
2. 海馬錐體細胞的樹狀棘密度的減少
Golgi染色和組織定量研究表明，SAMP8海馬錐體細胞樹突棘的密度發生了明顯的異常變化，與對照組R1相比，CA1和CA3 棘的密度明顯減少。說明進入該部位的錐體細胞突觸減少。考慮到海馬是記憶的重要結構，因此SAMP8的學習記憶障礙與此異常具有直接關系。
3. 增齡引起明顯的星形細胞增生
SAMP8發育早期即出現星形細胞的增生。應用 GFAP 染色觀察, 2月齡即可看到斑狀的星形細胞增生，推測這可能是對海綿狀變化的修復反應。增生發生于多個腦區，最明顯的部位與腦干海綿樣病變一致。另外，光學顯微鏡顯示海綿狀變化不明顯的其他部位，如大腦皮質的一部分、紋狀體、大腦基底部、腦干背側等也出現GFAP陽性星形細胞的增加。在上述相應部位, 對照組R1只在高齡時觀察到顯著的星形細胞增生，可能是增齡神經細胞脫落、突觸變性等多種多樣的原因所造成。但是，梨狀皮層與其他皮層相比，隨增齡的星形細胞增生是比較多的部位，同時出現隨增齡皮層變薄的傾向。
4. 多發PAS(希夫過碘酸)染色陽性顆粒狀結構
SAMP8 PAS染色陽性顆粒狀結構(PAS-positive granular structure, PGS)在腦內分布最常見的部位是海馬、梨狀皮層、嗅結節和小腦皮層等，特別是海馬的CA1、CA2和CA3最多。海馬的組織定量研究結果表明，PGS在SAMP8系的3月齡左右可以看到，6月齡后隨增齡急速增加。其具體變化過程是，自3月齡開始，PAS陽性顆粒出現于突觸后，進一步可見丘腦以及屬于邊緣系統的梨狀區神經核群發生變化。而對照組R1，只出現于少數老齡鼠。SAMP8平均壽命約為R1的一半，即使考慮平均壽命誤差，SAMP8 PGS的增加也非常顯著。因此PGS的出現及早期多發是其特異點之一。
PGS在老齡鼠的腦內怎樣形成仍然是個謎。PGS的特點是一個由數十個顆粒狀小體組成的聚集體，用GFA/PAS雙重染色，常常在聚集體的中央觀察到GFA陽性星形細胞，PGS簇集的大小正好和星形細胞突起延伸一致，一個個小體沿著突起分布。但是也可以考慮這是星形細胞的單純的反應表現，很可能PGS的形成過程與星形細胞有關。
迄今為止，還沒有人和其他動物關于PGS的報告。PGS是SAM新的形態學腦老化指標，同時又在學習記憶障礙的SAMP8多發。
5.血腦屏障的異常
血腦屏障(blood-brain barrier, BBB) 是由毛細血管形成的血漿與腦細胞外液間的屏障，可防止多種外源物質進入腦，但營養物質和代謝產物可順利通過, 保護腦的內環境高度穩定, 以利于中樞神經系統的機能活動。隨著中樞神經系統的老化，BBB的機能低下，導致外源物質易于侵入，出現腦損害。日本學者觀察了SAMP8和R1出現增齡血腦屏障的變化，尤其是內側海馬、背側丘腦和嗅球。
SAMP8大腦沒有表現出被視為阿爾茨海默病（AD）病理特征的形態學變化（即神經原纖維纏結和老年斑）；然而，SAMP8大腦顯示出AD的一些病理生理特征，即Aβ異常積聚和Aβ清除受損、tau蛋白過度磷酸化、氧化應激增加和膠質增生。基于目前的突變相關AD模型，很難確定老年人群中可以從該疾病中讀取的事件的時序。因此，SAMP8小鼠可能是研究與AD相關的最早神經退行性變化的極好模型，并為人類疾病提供了更全面的圖景——一種由與年齡相關的事件引發的綜合征。
五、SAMP8小鼠應用研究現狀
1、行為學特征
神經行為學實驗是研究動物學習記憶力障礙的主要方法。其方法主要有水迷宮、明暗箱、跳臺等。基本原理是利用動物覓食、求生、逃避傷害等本性設計實驗，觀察其近期和遠期學習記憶能力。Chen等用六臂水迷宮對SAMP8鼠進行行為學測試，發現在3個月時出現空間學習缺陷，5個月時出現空間記憶缺陷。SAMP8小鼠隨月齡增長學習記憶能力逐漸減退;與同齡對照組相比，8、12月齡SAMP8小鼠出現明顯衰老特征，表現出學習記憶能力明顯低下。由于各實驗室采取的實驗方法不同，在評估學習記憶力障礙發生的時間上報道不一致，但一般均認為，與正常老化的R1鼠相比，SAMP8鼠在8月齡出現明顯的學習記憶障礙。選擇2，6，10個月的SAMP8和SAMR1鼠用高架十字迷宮、曠野實驗、黑白巷、食物恐新實驗研究鼠的焦慮行為，發現在高架十字迷宮、黑白巷實驗中年齡的作用是很明顯的。高架十字迷宮實驗顯示SAMP8鼠隨年齡增加焦慮行為增加。10個月雄性SAMP8鼠有更明顯的焦慮行為。
2、形態學特征
SAMP8鼠的一些形態學特征已有相關報道：以腦干為中心出現海綿狀變化；海馬錐體細胞的樹狀棘密度減少；海馬、梨狀皮質、嗅結節和小腦皮質等多發部位PAS(希夫過碘酸)染色陽性顆粒狀結構；伴加齡出現血腦屏障(BBB)障礙。為了闡明SAMP8鼠海馬BBB水平，選擇3，7，12個月SAMP8和SAMR1檢測腦內源性IgG的外滲，發現12個月P8鼠IgG 有明顯的外滲，提示老齡SAMP8鼠BBB滲透性增加。另有學者報道，通過免疫組織化學方法用髓磷脂堿性蛋白(MBP)和2，3-環狀核苷酸3-磷酸二脂酶(CNP)作為少突膠質細胞標記研究SAMP8鼠腦內少突膠質細胞的變化發現：在10個月，SAMP8鼠海馬CA1與SAMR1鼠比較，MBP和CNP免疫反應陽性細胞明顯減少；而在10個月鼠齡大腦皮質和視神經束的MBP和CNP沒有明顯不同。結果顯示在SAMP8鼠海馬少突膠質細胞有隨增齡的退化。
3、腦內物質代謝異常
自由基對神經細胞的損傷可能是癡呆發病的主要原因之一。一氧化氮是一種不同于經典神經遞質的信息遞質。一氧化氮由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸產生。Colas等[8]用RT-PCR和生化技術觀測SAMP8鼠和SAMR1鼠，隨著年齡的增加，2個品系分別在8~12個月、2~8個月，在皮質和海馬nNOS的水平下降。在腦干，SAMP8鼠中nNOS mRNA下降，而在SAMR1鼠沒有下降。更重要的是，發現海馬區nNOS的活性在8個月SAMP8鼠比SAMR1鼠低，而在SAMP8鼠和SAMR1鼠的皮質和腦干，nNOS活性在8個月時增加然后隨著增齡下降。Sureda等研究發現，5個月的SAMP8鼠與SAMR1鼠的皮質比較，谷胱甘肽還原酶和過氧化物酶降低；用免疫印跡測得在雄鼠比雌鼠過氧化氫酶活性降低，這與過氧化氫酶低表達有關；神經細胞染色顯示在老的SAMP8鼠腦皮質神經細胞缺失，且發現在皮質細胞凋亡蛋白酶和鈣蛋白酶活性增加；用免疫染色也觀察到tau相關蛋白的形態學改變，預示結構功能的形態改變。
SAMP8鼠阿爾茨海默病的特征性蛋白-淀粉樣前體蛋白(APP)的表達也隨增齡顯著增加。免疫組織化學分析表明，海馬中淀粉樣蛋白斑的產生需要APP的表達達到一定的臨界量，認知能力的獲得與維持的缺陷可通過在腦室中注射β-APP抗體而減輕，說明β-APP的產生與認知能力的缺陷有關。Morley等研究表明腦室內注射β-淀粉樣蛋白單克隆和多克隆抗體可以改善學習和記憶缺陷，對癡呆相關疾病的治療提出了希望。SAMP8小鼠海馬8-氧鳥嘌呤核苷(8-oxo-G)的表達除1月齡外隨月齡增加而增加，提示8-oxo-G的表達增加與SAMP8小鼠的快速老化相關，有可能為增齡，甚至阿爾茨海默病的生物學標志[13]。電壓門控Na+通道Ⅱ型(SCN2b)參與了海馬和額葉正常生理功能的維持，其在額葉隨月齡增加的表達變化可能與衰老、認知記憶功能的減退有關。
4、激素變化
Landfield曾提出了糖皮質激素致腦老化學說。Flood等報道，SAMP8鼠在增齡過程中血漿睪酮水平明顯降低，8月齡時血漿睪酮水平下降43%(與4月齡相比)，12月齡時下降71%。如果外源性給予12月齡SAMP8鼠生理劑量睪酮與同月齡SAMP8鼠相比，可明顯改善其被動回避反應，認為睪酮改善學習記憶可能與其在腦內經芳香化酶作用轉變為雌激素，雌激素又促進了DA能神經元的功能有關。
5、神經營養因子變化
Miyazaki等通過RT-PCR、免疫組織化學等技術對SAMP8鼠、SAMP10鼠、SAMR1鼠進行有關膠質源性神經生長因子(Glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)方面研究，先檢測了3個品系海馬區GDNF mRNA表達。GDNF mRNA表達在SAMR1鼠下降，RT-PCR數據密度分析顯示10個月齡的GDNF表達是2個月齡表達的50%，而5個月表達是2個月齡表達的69%。在SAMP8鼠和SAMP10鼠沒有依賴年齡的GDNF mRNA表達不同；另一方面，在大腦皮質、腦干和其他區域沒有GDNF mRNA的改變。在2月齡的海馬，SAMP8鼠(約為對照組的49%，P < 0.05)和SAMP10鼠(約為對照組的41%，P < 0.05)GDNF mRNA的表達明顯比同齡SAMR1鼠低。然而，在10個月，SAMP8鼠表達與SAMR1鼠沒有不同，SAMP10鼠也無明顯下降。在SAMP8鼠和SAMP10鼠CA1區的錐體細胞層較薄，顯示CA1區錐體細胞層神經元數量的下降，沒有見到神經元與年齡有關的形態學改變。3個品系海馬CA1區生存神經元的數目表現為，在10月齡的SAMP8鼠和SAMP10鼠比2月齡下降約77%(P < 0.01)，比10個月的SAMR1鼠也下降。在SAMR1系沒有隨年齡的變化。結果表示幼鼠SAMP8和SAMP10低GDNF表達可能在海馬功能障礙方面(如與年齡相關的學習損害)起重要作用，而在老齡鼠海馬誘導神經死亡。
6、SAMP8小鼠學習記憶功能受恐懼、咀嚼和飲食影響
據報道，用SAMP8鼠和SAMR1鼠研究恐懼條件下學習和認知的缺陷。鼠被限制在特殊的實驗箱內，小鼠腳下有一個振蕩器制作緊張。條件形成后，對沒被緊張因素干預的小鼠和不同程度緊張因素干預的小鼠在非緊張條件下檢測，結果顯示SAMP8鼠被緊張因素干預后有學習和記憶缺陷。老齡鼠無臼齒可以引起海馬CA1區樹突棘數目的下降，表現為學習能力下降。老齡SAMP8鼠牙齒咬合失調時間越長，空間學習能力缺損越嚴重，海馬CA3區神經元數量下降越明顯。大鼠或小鼠的牙齒缺除損害空間記憶的獲得，表明咀嚼活動的減少可導致神經網絡功能的改變。飼喂不同食物對SAMP8鼠的智力衰退也有影響。如斷奶期后軟食飼喂減少大腦皮質突觸形成，損害成年期間空間學習能力。用磷脂酰膽堿加維生素B12飼喂SAMP8鼠可提高腦中蛋白激酶C的活性，增強學習能力。給動物正常食物40%的能量來限制飼喂SAMP8鼠，可有效抑制老化過程中與智力衰退關聯的異常。
7、SAMP8小鼠在評價改善學習記憶功能藥物及中醫方面的應用
SAMP8鼠由于具有典型的學習記憶功能衰退及老化癥狀，而被用于評價和干預老化關聯的疾病和改善學習記憶機能的藥物。傳統中藥六味地黃湯通過修飾一些基因的表達明顯提高SAMP8鼠中樞神經系統的認知功能。SAMP8鼠在增齡過程中血漿及中樞海馬、皮質內皮質酮水平明顯高于對照。血漿皮質酮水平升高可降低海馬神經元細胞內ATP水平，并誘導興奮性氨基酸堆積，口服六味地黃湯可顯著降低血漿皮質酮水平，同時使海馬ATP、ADP、AMP水平升高，從而改善SAMP8鼠的學習記憶功能。在體內研究中，用3個月的SAMP8鼠給予4種不同飲食，結果顯示補充提取物飲食的鼠比對照組有少的淀粉樣蛋白沉積和低水平硫代巴比土酸物質水平。Mak等給SAMP8鼠喂養銀杏葉提取物或蔗糖3周直到3或9個月時處死。喂銀杏葉提取物的9個月鼠海馬Bax/Bcl-2表達率明顯低于喂蔗糖鼠Bax/Bcl-2表達率。
然而，在大腦皮質區沒有明顯的不同。銀杏葉提取物組明顯下降，對海馬衰老有保護作用，進一步降低細胞凋亡。免疫印跡法證實了短期后Bax的下降和高劑量銀杏的治療作用。推測銀杏葉提取物可能通過調節海馬Bax和Bcl-2的不同表達抵抗凋亡作用。Yang等探討“益智健腦粒濃縮液”對SAMP8鼠海馬神經元、行為和凋亡基因bcl-2，bax的作用，進一步探討傳統中藥YCF(yizhi jiannao granule concentration fluid)對提高學習和記憶的分子機制。結果顯示，在YCF組，逃避潛伏期明顯縮短，扇形平臺游泳時間明顯增加，海馬神經凋亡率下降，Bcl-2水平和Bcl-2/Bax增加，Bax下降。得出結論：益智健腦粒能降低神經元凋亡率和Bax水平，增加Bcl-2水平，調節Bcl-2/Bax，這可能是益智健腦粒抑制凋亡作用、提高學習和記憶的部分機制。黃連解毒湯喂養的SAMP8鼠海馬和大腦皮質62種基因表達的改變提出黃連解毒湯緩解認知缺陷作用是通過多種機制、多靶點實現的。用褪黑素皮下注射治療4個月和7個月的SAMP8鼠，結果顯示褪黑素在提高學習記憶能力的同時明顯提高海馬錐體細胞的數量，而4個月的SAMP8鼠表現更明顯，提示褪黑素對SAMP8海馬的保護作用有年齡依賴性。用SAMP8鼠研究“益氣調穴扶本培元”針刺的作用，針刺誘導SAMP8鼠不同腦區細胞的增殖，新生細胞連續分布在海馬槽的背面，從側腦室延伸到胼胝體，揭示了針刺提高認知缺陷的機制。用烏龍茶、綠茶喂養6個月的SAMP8鼠16周，烏龍茶、綠茶能降低SAMP8鼠的認知缺陷、降低鼠腦的退行性變和衰老進程，可能與茶潛在的抗氧化應激有關。
六、飼料
大小鼠繁殖飼料
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